上海盈飞生物科技有限公司

RSEM: Align and Estimate Abundance（RSEM方法比对和表达量计算）

分析模块，封装了Trinity程序包中的“align_and_estimate_abundance.pl”脚本，进行原始数据与转录本序列的比对和表达量计算。其中，核心程序为，Bowtie或Bowtie2进行原始数据与转录本序列的比对，RSEM根据比对结果进行表达量的计算。核心程序相关参数为，Bowtie：'--all --best --strata -m 300 --chunkmbs 512'。Bowtie2：'--no-mixed --no-discordant --gbar 1000 --end-to-end'。RSEM：默认参数。

分析模块，输入构建好索引的转录本参考文件（由分析模块“Build Transcript Reference Index”生成），以及转录组测序原始数据（fastq文件）。这里，推荐测序原始数据，先通过分析模块“Trimmomatic PE/SE”进行去接头污染和质量控制。

分析模块，将转录组测序原始数据（fastq文件数据）比对回转录本参考序列，生成bam格式的比对结果文件，转录本水平表达结果文件，基因水平表达结果文件。

注：bam文件，可以利用IGV软件打开，查看比对结果。

IGV安装和使用，包含Windows桌面版和iPad版，官方网站提供了详细的文档。参考网站：（http://www.broadinstitute.org/igv/）。

输入测序数据分两种模式（SE/PE）：

选择Paire-End时，分析模块处理双末端测序数据，需提供2个fastq原始数据文件，分别对应左端和右端测序结果。

选择Single-Single时，分析模块处理单末端测序数据，需提供1个fastq原始数据文件。

输入：

1、构建好索引的转录本参考文件，由分析模块“Build Transcript Reference Index”生成。

2、fastq格式的测序原始数据文件。

示例：

@ecoli_section_9642_10205_3:0:0_1:0:0_0/1

CCCGCCATCTCTTGCAGAAGCGCCTGTTGCTGTACATGGTGCATTCGCATCCCCATCCCTACGCGGCTTC

2222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222

如果，转录组是链特异性建库测序，则需要设置链特异性文库类型。

PE测序，FR表明paired-reads与转录本一致，RF表明paired-reads与转录本反向互补链一致。

SE测序，F表明read与转录本对应，R表明read对应转录本反向互补链。

输出：

1、bam格式的比对结果文件。

关于Bowtie输出的BAM/SAM格式介绍，参考：（http://bowtie-bio.sourceforge.net/manual.shtml#sam-bowtie-output）。

关于Bowti2输出的BAM/SAM格式介绍，参考：（http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml#sam-output）。

2、RSEM转录本水平表达结果文件。

其中，每一列的含义如下所示：

l transcript_id，transcript name of this transcript.

l gene_id，gene name of the gene which this transcript belongs to.

l length，this transcript's sequence length.

l effective_length，counts only the positions that can generate a valid fragment.

l expected_count，the sum of the posterior probability of each read comes from this transcript over all reads.

l TPM，Transcripts Per Million. It is a relative measure of transcript abundance. The sum of all transcripts' TPM is 1 million.

l FPKM，Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads.

l IsoPct，It is the percentage of this transcript's abandunce over its parent gene's abandunce. If it’s parent gene has only one isoform, this field will be set to 100.

3、RSEM基因水平表达结果文件。

其中，一些列的含义如下所示：

l gene_id，gene name of the gene

l transcript_id(s)，a comma-separated list of transcript_ids belonging to this gene.

l Length，weighted average of its transcripts' lengths (weighted by 'IsoPct').

l effective_length，weighted average of its transcripts' effective lengths (weighted by 'IsoPct').

l expected_count、TPM、FPKM，为对应基因包含的所有转录本的数值求和。

后续的下游分析，如，差异表达分析、热图、PCA等。通常情况下，基于expected_count和FPKM的数值进行分析，即基因原始片段数估算结果和FPKM数值估计结果。

分析模块引用了Trinity v2.0.6程序包中的“align_and_estimate_abundance.pl”脚本（https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki）。

分析模块引用了Bowtie-0.12.7软件（http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml）。

分析模块引用了Bowtie2-2.1.0软件（http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml）。

分析模块引用了RSEM-1.2.26软件（http://deweylab.github.io/RSEM/）。