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分析模块，输入构建好BWA索引的参考序列（由分析模块“BWA reference index”生成），以及测序原始数据（fastq文件）。这里，推荐测序原始数据，先通过分析模块“Trimmomatic PE/SE”进行去接头污染和质量控制。 分析模块，利用bwa aln算法（适合短序列），将测序原始数据（fastq文件）比对回参考序列，生成sam格式的比对结果文件。 注：sam文件为文本格式文件，可用Windows写字板打开查看。这里，建议先将sam文件转成bam文件，bam文件排序之后，利用IGV软件打开，查看比对结果。 IGV安装和使用，包含Windows桌面版和iPad版，官方网站提供了详细的文档。参考网站：（http://www.broadinstitute.org/igv/）。 BWA输入测序数据分两种模式（SE/PE）：
选择Paired fastq时，分析模块会对双末端数据进行比对，用户需提供2个fastq原始数据文件，分别对应DNA片段的左端和右端测序结果。 选择Single fastq时，分析模块会对单末端数据进行比对，用户需提供1个fastq原始数据文件。 输入： 1、构建好BWA索引的参考序列文件，由分析模块 "BWA reference index" 生成 2、fastq格式的测序原始数据文件。 示例： @ecoli_section_9642_10205_3:0:0_1:0:0_0/1 CCCGCCATCTCTTGCAGAAGCGCCTGTTGCTGTACATGGTGCATTCGCATCCCCATCCCTACGCGGCTTC + 2222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222 输出： sam格式的比对结果文件。 示例： @SQ SN:ecoli_section LN:30000 @RG ID:ecoli_A1 SM:ecoli_A1 @PG ID:bwa PN:bwa VN:0.7.12-r1039 ecoli_section_9642_10205_3:0:0_1:0:0_0 83 ecoli_section 10136 60 70M = 9642 -564 GAAGCCGCGTAGGGATGGGGATGCGAATGCACCATGTACAGCAACAGGCGCTTCTGCAAGAGATGGCGGG 2222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222 RG:Z:ecoli_A1 XT:A:U NM:i:1 SM:i:37 AM:i:37 X0:i:1 X1:i:0 XM:i:1 XO:i:0 XG:i:0 MD:Z:56G13 ecoli_section_9642_10205_3:0:0_1:0:0_0 163 ecoli_section 9642 60 70M = 10136 564 CAGATGTCGATCCCATCGCCATTGCTGAAATCGGCATCCTTACCAGGGCAATTTTCGTGTTCCGTTTCAT 2222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222 RG:Z:ecoli_A1 XT:A:U NM:i:3 SM:i:37 AM:i:37 X0:i:1 X1:i:0 XM:i:3 XO:i:0 XG:i:0 MD:Z:30G2C4A31 ecoli_section_3782_4324_1:0:0_3:0:0_1 83 ecoli_section 4255 60 70M = 3782 -543 GAGCCCGAATAAACGGTCTCAGCCAGTTAAGGCACTCCGACAAGAAATTAGCCCAGCTAATGGGGCATTG 2222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222 RG:Z:ecoli_A1 XT:A:U NM:i:3 SM:i:37 AM:i:37 X0:i:1 X1:i:0 XM:i:3 XO:i:0 XG:i:0 MD:Z:2T51C2A12 SAM格式说明： SAM是一种序列比对格式标准，由Sanger制定，是以TAB为分割符的文本格式，主要应用于测序片段（Query）比对到参考序列上的结果保存。 关于SAM格式的详细介绍，参考文档：（https://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf）。或者Google搜索SAM format。 SAM文件分为两部分：注释信息部分（header section）和比对结果部分（alignment section）。注释信息部分属于可选部分，以@开头，用不同的字母表示不同的信息。主要有：@HD，表明SAM文件的格式版本、比对结果的排序方式；@SQ，表明参考序列的信息，如染色体名称，序列长度等；@RG，表明测序序列（Query）的信息，如文库名、样品名、测序平台等；@PG，表明使用的程序信息，如程序名称、版本等；@CO，任意的注释信息。 比对结果部分（alignment section），每一行表示对应Query的一个比对结果信息。包括11个必须的字段（mandatory fields）和一个可选的字段，字段之间用TAB进行分隔。必须的字段有11个，顺序固定，如果字段的信息不可用，视具体字段用’0‘或’*‘进行表示， 11个字段从左到右，依次为： 1、QNAME，测序序列（Query）的名称； 2、FLAG，位标识，用数字表示Query的比对情况，每一个数字代表一种比对情况，这里的值是所有符合情况的数字相加。数字的具体含义，参考如下所示的FLAG说明； l |0x0001 (1)| the read is paired in sequencing l |0x0002 (2)| the read is mapped in a proper pair l |0x0004 (4)| the query sequence itself is unmapped l |0x0008 (8)| the mate is unmapped l |0x0010 (16)| query being reverse complemented l |0x0020 (32)| mate being reverse complemented l |0x0040 (64)| the read is the first read in a pair l |0x0080 (128)| the read is the second read in a pair l |0x0100 (256)| the alignment is not primary l |0x0200 (512)| the read fails quality controls l |0x0400 (1024)| the read is either a PCR or an optical duplicate 3、RNAME，比对上的参考序列名称。对于没有比对上的结果，用’*‘表示； 4、POS，比对上的参考序列位置坐标，从1开始计数（1-based leftmost position）。对于没有比对上的结果，用’0‘表示； 5、MAPQ，比对的质量值； 6、CIGAR，简要比对信息表达式（CIGAR，Compact Idiosyncratic Gapped Alignment Report），其以参考序列为基础，使用数字加字母表示比对结果。比如，3S6M1P1I4M，前三个碱基被剪切去除了，然后6个比对上了，然后打开了一个缺口，有一个碱基插入，最后4个比对上了。对于没有比对上的结果，用’*‘表示。每个字母的具体含义，参考如下所示的说明； l M alignment match (can be a sequence match or mismatch) l I insertion to the reference l D deletion from the reference l N skipped region from the reference l S soft clipping (clipped sequences present in SEQ) l H hard clipping (clipped sequences NOT present in SEQ) l P padding (silent deletion from padded reference) l = sequence match l X sequence mismatch 7、RNEXT，PE测序另一端read比对上的参考序列名称。如果信息不可用，用’*‘表示。如果比对上的序列与RNAME相同，用’=‘表示； 8、PNEXT，PE测序另一端read比对上的参考序列位置坐标，如果信息不可用，用’0‘表示； 9、TLEN，PE测序数据，根据比对结果推断的插入片段大小，如果是SE测序或者信息不可用，用’0‘表示； 10、SEQ，Query对应的序列信息，Query序列与参考序列具有同样的方向； 11、QUAL，Query序列的测序质量值信息。 可选字段（optional fields)，格式如：TAG:TYPE:VALUE，每个TAG代表一类信息， TYPE表示TAG对应值的类型，可以是字符串、整数、字节、数组等，一些TAG及其含义如下所示： l NM Edit distance l MD Mismatching positions/bases l AS Alignment score l BC Barcode sequence l X0 Number of best hits l X1 Number of suboptimal hits found by BWA l XN Number of ambiguous bases in the referenece l XM Number of mismatches in the alignment l XO Number of gap opens l XG Number of gap extentions l XT Type: Unique/Repeat/N/Mate-sw l XA Alternative hits; format: (chr,pos,CIGAR,NM;)* l XS Suboptimal alignment score l XF Support from forward/reverse alignment l XE Number of supporting seeds 注：X开头的TAG是BWA特有的TAG。 绝大多数情况下，使用BWA的默认参数进行比对即可。如需进行个性的调整，更改对应的参数即可。 分析模块引用了BWA v0.7.12软件（http://bio-bwa.sourceforge.net/）。 相关文献如下所示： Li H. and Durbin R. (2009) Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform. Bioinformatics, 25:1754-60. [PMID: 19451168] Li H. and Durbin R. (2010) Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler Transform. Bioinformatics, Epub. [PMID: 20080505] |
