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Differential Expression Analysis（差异表达分析，支持edgeR、DE

分析模块，封装了Trinity程序包中的“run_DE_analysis.pl”脚本，进行差异表达分析。可以，选择三种不同的分析方法，分别为：edgeR、DESeq2、limma。其中，edgeR支持单个样品，也支持重复样品之间的差异表达分析。DESeq2和limma只支持重复样品之间的差异表达分析。

分析模块需要提供测序片段计数矩阵（Count Matrix），其中，样品名由数字、字母和下划线组成（不要包含空格等其他字符）。计数矩阵（Count Matrix），可通过模块栏目：“NGS: I.RNA-Seq Expression Calculation”下的模块，对原始数据进行比对、计算、合并得到。

edgeR和DESeq2直接进行差异分析，limma利用voom转换后的数据进行差异分析。详细参考相应的文献信息。

注意：分析模块不支持，FPKM矩阵等均一化之后的数据进行差异表达分析。

输入：

1、测序片段计数矩阵（Count Matrix）。

示例：

T4 T5 T6 T7 T8 T9

BM590_A0001 565 505 843 286 247 1909

BM590_A0002 362 295 512 124 118 876

BM590_A0003 235 213 333 126 47 1021

BM590_A0004 291 325 447 404 878 1600

BM590_A0005 530 607 848 709 1194 2001

BM590_A0006 456 425 786 287 139 1857

BM590_A0007 21 16 27 1 3 26

BM590_A0008 282 252 425 85 46 843

……

2、重复样分组信息文件（edgeR可选，DESeq2和limma必须）。其中，第一列为样品名称，第二列为分组名称。

示例：

T4 group1

T5 group1

T6 group1

T7 group2

T8 group2

T9 group2

输出：

HTML格式结果文件，链接所有样品或分组之间的差异表达分析结果。提供分组信息文件，输出分组之间的差异分析结果。反之，输出样品间的差异分析结果。

示例：

HTML文件链接如下后缀的文件，具体如下所示：

（1）、*.DE_results文件，差异表达分析结果文件（文本文件，可用写字板，或Excel打开查看）。按检验的p值由小到大进行排序。

其中，*.edgeR.DE_results文件，为选择edgeR方法的分析结果。对应的列从左到右，依次为id、logFC、logCPM、Pvalue、FDR。

示例：

logFC logCPM PValue FDR

BM590_B0190 -6.22004162791632 13.3689809907188 2.98996378853995e-14 1.02137163016525e-10

BM590_B0191 -6.13104867587805 10.0374982362663 1.12830573683373e-13 1.92714619851201e-10

BM590_A0444 -5.49159468960263 12.9054578419781 3.92883335526202e-12 3.39358904855402e-09

其中，*.DESeq2.DE_results文件，为选择DESeq2方法的分析结果。对应的列从左到右，依次为id、baseMeanA、baseMeanB、baseMean、log2FoldChange、lfcSE、stat、pvalue、padj。

示例：

id baseMeanA baseMeanB baseMean log2FoldChange lfcSE stat pvalue padj

BM590_B0229 158.98500245234 20.4873928627442 89.736197657542 -2.77996667570144 0.275419809016736 -10.093561119028 5.89898095229944e-24 2.00211413521043e-20

BM590_A1150 115.630330206523 329.186305632427 222.408317919475 1.45325162909141 0.195306253915068 7.44088630015596 1.00012000838412e-13 1.69720365422786e-10

BM590_A1969 102.957928606499 27.5394749915221 65.2487017990105 -1.73283449312105 0.244551689813904 -7.08575963813492 1.38283643518483e-12 1.56444895367244e-09

其中，*.limma.DE_results文件，为选择limma方法的分析结果。对应的列从左到右，依次为id、logFC、logCPM、Pvalue、FDR。

示例：

logFC logCPM PValue FDR

BM590_B0229 -3.07365718063767 6.67162693503122 0.000135691101766479 0.0772760824560096

BM590_Bt10 -3.45627760166394 3.00750469759457 9.68779097236066e-05 0.0747660968992843

BM590_Ar45 -2.80844908981892 2.72227474712603 0.000109403126864624 0.0747660968992843

需要注意的是，假设，文件名包含：__sample1_vs_sample2__，logFC的值对应为：log2(sample2/sample1)。sample2比sample1表达量高，则logFC为正值，sample2比sample1表达量低，则logFC为负值。

通常，会根据logFC、p值、q值进行差异表达结果的过滤和筛选。

（2）、*.MA_plot.pdf文件，MA图。

注：每个点代表一个基因。对于edgeR和limma，横坐标为logCPM，纵坐标为logFC。对于DESeq2，横坐标为log2(baseMean+1)，纵坐标为logFC。其中，黑色点代表没有差异表达的基因，蓝色点代表下调的基因，红色点代表上调的基因。

（3）、*.Volcano_plot.pdf文件，火山图。

注：每个点代表一个基因。横坐标为logFC，纵坐标为-1*log10(FDR)。其中，黑色点代表没有差异表达的基因，蓝色点代表下调的基因，红色点代表上调的基因。

分析模块引用了Trinity v2.2.0程序包中的“run_DE_analysis.pl”脚本（https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki）。

edgeR，分析模块引用了R语言（v3.2.3）edgeR包（v3.10.2）进行差异表达分析（http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html）。

DESeq2，分析模块引用了R语言（v3.2.3）DESeq2包（v1.8.1）进行差异表达分析（http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html）。

limma，分析模块引用了R语言（v3.2.3）limma包（v3.24.14）进行差异表达分析（http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html）。